一种骨质疏松斑马鱼模型的构建方法及其应用_2014105154044_说明书_专利查询_专利网

技术田

本发明物触及麦克匪特斯氏疗法技术田。,详细的触及一种壳硬朊模糊的斑马鱼以前的的排列办法及其用功。

放技术

壳硬朊模糊的症(壳硬朊模糊的症),OP)是骨量增加。、一种以骨规划变性和风险为特点的呕吐。。它所产生的为害越来越原因民间音乐的关怀。,精力充沛的生长壳硬朊模糊的药物已逐渐译成很经过。。药物细想与开发,试验以前的尤为要紧。。细胞以前的,其功用关联单一。,药物总体观难以表现,两个都不能够在体内引起评价药物。;惯例牲口,如捕鼠,是一种药物滤除以前的,由于它的H,成型长期的。,不能够检查和状态昌盛正中鹄的缺陷。,高通量滤除的用功是有限的的。。

斑马鱼,一种寒带鲤科东西。。由于它的成团卷起很小。,快速地繁衍过去某一假定历史时期的、胚胎透迷、骨长神速。、它与人类孟德尔基因和发令枪声入口高尚的同族。,并逐渐用功于骨呕吐以前的的细想。。临床上,踏出的路或弘量糖皮质激素治愈的病人能够有反功能。,糖皮质激素也可原因捕鼠和如此等等牲口的壳硬朊模糊的症。。从鱼到哺乳牲口,糖皮质激素零碎是高尚的守旧的。,从此,糖皮质激素也被用功于斑马鱼壳硬朊模糊的以前的的扩展。骨染上或粘上是核心最根本的细想办法。,惯例的染上或粘上剂为钙黄绿素(钙黄绿素)。,槲皮素(槲皮素)和茜素红(茜素红)等。。就中,茜素红染上或粘上次要与钙水合氢螯合。,是眼前细想斑马鱼刺矿化使习惯于的次要办法。又,该办法在试验转换中是繁琐的。,破费长期的,染上或粘上引起不稳的等。。

孟德尔基因转变技术是晚近用功于斑马鱼停止呕吐以前的或孟德尔基因分子程度细想的新办法。惯例孟德尔基因转变斑马鱼技术是经过显微喷湿将外源DNA如报道孟德尔基因GFP(green fluorescent protein)或(RFP,喷湿到精子正中鹄的白色荧光灯朊。,大意是其遵从到斑马鱼孟德尔染色体组中并在假定规划和器官中表达。这种办法是无能的的。,双亲遗传可能性低。。

发明物质地

为了处理是你这么说的嘛!成绩,本发明物因为Tel2网关技术的用功。,排列规划种别性助长者报道孟德尔基因,如GFP O,将该质体和离体分解的相当的转座酶mRNA共喷湿到单细胞期的斑马鱼胚胎中。因为转贱的的字母,它能长高效的孟德尔基因转变和遗传。,一次喷湿成功率和大发牢骚稳固性大幅增大。。)排列了核心报道绿色荧光灯的孟德尔基因转变斑马鱼,联合体该品系斑马鱼排列了糖皮质激素引起的壳硬朊模糊的斑马鱼以前的,该以前的用于抗壳硬朊模糊的药物的高通量滤除。。

从此,本发明物的意志符合储备物质一种壳硬朊模糊的斑马鱼以前的的排列办法,它包含以下过程:

1、斑马鱼的繁衍;

2、孟德尔基因转变斑马鱼的排列;

3、采取药物对孟德尔基因转变斑马鱼停止造模;

就中,在过程2所述的孟德尔基因转变斑马鱼的排列转换中,用功tol2-gateway孟德尔基因转变技术辨别排列质体5’Entry clone:p5E-Osterix,Middle Entry clone:pME-nls EGFP和3’Entry clone:p3E-Poly A,三零件LR返回停止。,推进表达质体pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA,最后的,将表达质体与TL2mRNA混合。,显微喷湿到斑马鱼胚胎细胞中。

在本发明物的偏爱的事物手段例中。,过程2中所述的表达质体pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA的创作如附图1所示。

在本发明物的偏爱的事物手段例中。,在过程3中应用的药物是地塞米松DEX。,姣姣者浓度为10μm。。

在本发明物的技术谋划中。,还增进包含对壳硬朊模糊的斑马鱼以前的停止评价证明的过程。

在本发明物的偏爱的事物手段例中。,评价证明包含药物评价的证明。、骨盐沉积定量剖析、骨相干免疫因子程度变更的行动剖析与检查。

在本发明物的增进偏爱的事物手段谋划中。,用于药物评价和证明的药物为地塞米松DEX A。,淫羊藿总黄酮Fe的姣姣者使分娩浓度为1 g/ml。。

本发明物再一在实地工作的还储备物质了本发明物所述的壳硬朊模糊的斑马鱼以前的在滤除抗壳硬朊模糊的药物正中鹄的用功。

在本发明物的偏爱的事物手段例中。,药物是骨吸取延缓剂。、促骨长药物、骨盐沉积助长药物与国药。

在本发明物的增进偏爱的事物手段谋划中。,骨吸取延缓剂是双膦酸盐。、降血钙素、雌酮、雌酮接受器调节剂与黄酮使严重,促骨长药物为氟预备、甲状旁腺激素预备、活动维他命D预备,钙矿化助长骨盐沉积。、维他命D及其活动代谢物。

在本发明物的增进偏爱的事物手段谋划中。,国药是淫羊藿。、熟地、杜仲、丹参、膜荚黄芪与Fructus Cnidii。

本发明物是因为Tel2网关技术的用功。,成骨细胞种别性混频免疫因子助长者的推进,排列出核心报道绿色荧光灯的孟德尔基因转变斑马鱼,联合体该品系斑马鱼修建糖皮质激素引起的壳硬朊模糊的斑马鱼以前的,同时,用Z法对淫羊藿总黄酮停止了评价。,最后使知晓,用该办法构成的以前的是便利的。、可能的、无效,它比惯例的骨扣紧染上或粘上办法更稳固。、省时、高效,遵从的抗壳硬朊模糊的药物的高通量滤除。

附图阐明

图1为表达质体pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA的创作示意图。

图2为排列核心带绿色荧光灯标志孟德尔基因转变斑马鱼长变更示意图。

图3为不一样增味剂地塞米松DEX引起斑马鱼壳硬朊模糊的致使骨量损失示意图。

a:茜素红染上或粘上中骨损失的示意图;

b:骨损失荧光灯显示示意图;

c:B图DMSO群矩形广场长骨细胞SGE的缩小与显示;

d:10μm矩形盒中成骨细胞增加的示意图。

图4是骨盐沉积定量I的示意图。。

a:茜素红染上或粘上区示意图;

b:荧光灯面积定量示意图;

c:荧光灯使整合光密度IOD量子化示意图。

图5用不一样增味剂地塞米松地塞米松治愈。,斑马鱼行动学剖析示意图。

a:斑马鱼游水航线示意图;

b:游水航线定量图。

图6淫羊藿总黄酮FE对两种办法的斑马鱼壳硬朊模糊的防治引起示意图。

a:FE对野生型斑马鱼壳硬朊模糊的骨量损失防治功能示意图;

b:FE对荧光灯斑马鱼壳硬朊模糊的骨量损失防治功能示意图;

图7为淫羊藿总黄酮FE对两种办法的斑马鱼壳硬朊模糊的防治引起停止量子化示意图。

a:茜素红染上或粘上区示意图;

b:荧光灯面积定量示意图;

c:荧光灯使整合光密度IOD量子化示意图。

图8为淫羊藿总黄酮FE对斑马鱼壳硬朊模糊的防治引起行动学剖析示意图。

a:FE对斑马鱼游水资格引起示意图;

b:游水航线定量图。

图9是骨相干免疫因子程度变更的示意图。。

详细的手段方法

经过示例储备物质了对本发明物的增进详细的叙述。,本发明物意在阐明本发明物而不是支配权。。一定点明的是,现场技工,不脱本发明物的规律。,也可以对本发明物停止必然的改良和修正。,这些改良和修正也属于防守视野。。

手段例1斑马鱼的繁衍

斑马鱼(广东医林附设收容所斑马鱼模特儿牲口平台储备物质)饲养于特意的玻璃鱼缸中,把持阳光过去某一假定历史时期的(照明14小时),反动的正中鹄的10小时。前一天黄昏将产卵期的雄鱼与雌鱼(1:2)放于繁衍缸中,秒天搜集精子。,停车陪替氏培育皿中。,同时进入胚水(5mm NaCl)。, KCl, CaCl2, MgSO4),常温培育箱孵化。斑马鱼胚胎普通7天内不必喂食。

手段例2孟德尔基因转变斑马鱼的排列

一、试验办法

用功tol2-gateway孟德尔基因转变技术排列质体5’Entry clone:p5E-Osterix,Middle Entry clone:pME-nls EGFP和3’Entry clone:p3E-Poly A。将是你这么说的嘛!三个质体停止三零件LR返回。,推进表达质体pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA。

早晨,受精胚胎收集后,它扣紧在取得洋菜冻胶的盘子里。,把表达质体pDestTol2CG2-osterix-nls-EGFP-pA与Tol2mRNA混合(终极浓度为50ng/μl),显微喷湿入一细胞期的斑马鱼胚胎细胞中。隔天,荧光灯显微镜用于滤除鱼的绿色荧光灯。,F0代成鱼导致。在此基础上,将F0代与野生型穿越推进TH。,非常的的以环连结,F3代开端用于试验。。

二、试验结局

最要紧的是什么?

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